Стволовые клетки могут вызывать развитие опухолевого процесса

Способность к самообновлению и дифференцировке в любые клеточные типы взрослого организма делает плюрипотентные клетки человека (эмбриональные стволовые клетки – ЭСК и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – иПСК) потенциальным источником материала для клеточной терапии. Сегодня клеточная терапия является предметом многочисленных исследований, призванных оценить её безопасность. Большинство учёных уже в течение многих лет сосредотачивают своё внимание на возможной туморогенности используемых клеток [1].

Поскольку генетические нарушения могут инициировать злокачественное перерождение, крайне важно, чтобы клеточные культуры, предназначенные для применения в клинике, были генетически стабильны. Некоторые линии ЭСК человека, как было показано в нескольких работах, при культивировании склонны к приобретению анеуплоидии [2-6], а наиболее распространённые хромосомные изменения в ЭСК, такие как трисомии по хромосомам 12 и 17, также характерны для клеток злокачественных эмбриональных опухолей [7-9]. Анеуплоидии могут быть обнаружены с помощью кариотипирования, однако более сложно обнаруживаемые субхромосомные перестройки, касающиеся групп по несколько нуклеотидов или даже единичных нуклеотидных замен, также могут оказаться причиной озлокачествления клеток. Такие нарушения могут быть выявлены лишь с помощью сравнительной геномной гибридизации (comparative genomic hybridization, CGH-анализ) или анализа единичных нуклеотидных замен (single-nucleotide polymorphism, SNP-анализ) [10-12].

В январе 2011 г. в журнале Cell Stem Cell были опубликованы результаты первого масштабного исследования, посвящённого детальному SNP-анализу большого количества линий ЭСК (69 линий, 130 образцов), иПСК (37 линий, 56 образцов), соматических клеток (11 линий, 11 образцов), первичных культур (41 линия, 41 образец) и 20 различных тканей (67 образцов) человека. В работе параллельно использовалось 2 алгоритма SNP-анализа: CNVPartition (Illumina, Inc., США) и Nexus (Biodiscovery, Inc., США) для исключения возможных ошибок и получения максимально объективных данных. Все результаты были верифицированы с помощью количественной полимеразной цепной реакции. Было обнаружено, что в ДНК ЭСК и иПСК, в отличие от линий соматических клеток и первичных культур, присутствует большое количество генетических нарушений. Более того, авторы работы выявили конкретные области генома, в которых возникают нарушения у различных линий плюрипотентных клеток.

В ЭСК в сравнении с дифференцированными клетками было обнаружено достоверно более частое возникновение дупликаций в 152 областях генома. Наиболее важными были дупликации на хромосоме 12, затрагивающие область генов плюрипотентности Nanog и Oct4/Pou5f1 и псевдогена NanogP1 (в 9 линиях ЭСК), и на хромосоме 20, затрагивающие область выше гена метилтрансферазы DNMT3B (в 7 линиях ЭСК, а также в 1 линии иПСК). При этом часть дупликаций захватывала и сам ген DNMT3B (в 6 линиях ЭСК). Подобные дупликации характерны для клеток многих злокачественных опухолей [13-16]. В процессе длительного культивирования (более 80 пассажей) эти хромосомные изменения сохранялись и накапливались, то есть клетки, несущие их в своей ДНК, имели селективное преимущество.

Для иПСК исследователи оценивали накопление хромосомных аберраций на трех этапах: сразу после их получения (репрограммирования эмбриональных фибробластов линии HDF51, предварительно подвергнутых тщательному SNP-анализу), в процессе длительного культивирования, а также после индукции процесса спонтанной дифференцировки. Обнаружилось, что для иПСК сразу после репрограммирования и на ранних пассажах (5-8 пассажи), в отличие от ЭСК, характерны не дупликации генов плюрипотентности, а делеции в областях генома, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста (например, гена FRS2). В исходной линии фибробластов подобных нарушений обнаружено не было. В процессе длительного культивирования (25-34 пассажей) в иПСК появлялись также дупликации генов, чья повышенная экспрессия ассоциирована со злокачественным перерождением клеток: RHOC, NRAS, AKT3, MDM2, CTAGE4 [17]. Также было показано, что в процессе спонтанной дифференцировки в иПСК происходит резкое увеличение количества генетических аберраций, причём в культуре росло количество клеток с делециями в областях генов-супрессоров опухолевого роста и дупликациями онкогенов (исследователи оценивали клетки на 2 и на 7 сутки после запуска процесса спонтанной дифференцировки). Всего было оценено 12 клонов иПСК, полученных из одной и той же линии эмбриональных фибробластов, и во всех случаях наблюдалась одна и та же картина. Таким образом, не только культивирование, но и дифференцировка оказалась высокоселективным процессом, в ходе которого преимущество получали клетки с аберрантным геномом.

Результаты этого глубокого и тщательного исследования весьма тревожны. Плюрипотентные клетки человека склонны к накоплению генетических нарушений, не обнаруживаемых с помощью рутинных процедур, таких как кариотипирование и другие методы, основанные на использовании световой микроскопии. Важно, что исследователям так и не удалось установить, в какой момент в клетках – как в ЭСК, так и в иПСК – появляются субхромосомные нарушения, поскольку клетки содержали их уже на самых ранних пассажах. При этом нарушения были не случайными, а повторялись в различных линиях ЭСК и иПСК, и можно с уверенностью сказать, что плюрипотентные клетки склонны к накоплению дупликаций в областях генома, содержащих гены плюрипотентности и онкогены, а также делеций в областях генов-супрессоров опухолевого роста. Всё это может послужить причиной развития опухолевого процесса при попадании подобных клеток и их производных в организм реципиента, а потому требуются исследования, направленные не только на разработку методов контроля генетической стабильности плюрипотентных клеток, но и на создание способа предотвращения генетических аберраций. Возможно, необходимо пересмотреть стандартные методы получения и условия культивирования клеток, поскольку без гарантии генетической стабильности плюрипотентные клетки не могут рассматриваться как источник дифференцированных клеток для трансплантаций в клинике.

По материалам: Laurent L.C., Ulitsky I., Slavin I. et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramminh and time in culture. Cell Stem Cell 2011; 8: 106-18.

Библиография

1. Fox J.L. FDA scrutinizes human stem cell therapies. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 598-9[Abstract]

2. Baker D.E., Harrison N.J., Maltby E. et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 207-15 [Abstract]

3. Draper J.S., Smith K., Gokhale P. et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 53-4[Abstract]

4. Imreh M.P., Gertow K., Cedervall J. et al. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.J. Cell. Biochem.2006; 99: 508-16 [Abstract]

5. Maitra A., Arking D.E., Shivapurkar N. et al. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat. Genet.2005; 37: 1099-103[Abstract]

6. Mitalipova M.M., Rao R.R., Hoyer D.M. et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.Nat. Biotechnol.2005; 23: 19-20 [Abstract]

7. Atkin N.B., Baker M.C. Specific chromosome change, i(12p), in testicular tumours? Lancet 1982; 2: 1349 [Abstract]

8. Rodriguez E., Houldsworth J., Reuter V.E. et al. Molecular cytogenetic analysis ofi(12p)-negative human male germ cell tumors. Genes Chromosomes Cancer 1993; 8: 230-6 [Abstract]

9. Skotheim R.I., Monni O., Mousses S. et al. New insights into testicular germ cell tumorigenesis from gene expression profiling. Cancer Res. 2002; 62: 2359-64 [Abstract]

10. Lefort N., Feyeux M., Bas C. et al. Human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20q11.21. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1364-6 [Abstract]

11. Naervae E., Autio R., Rahkonen N. et al. High-resolution DNA analysis of human embryonic stem cell lines reveals culture-induced copy number changes and loss of heterozygosity. Nat. Biotechnol. 2010; 28: 371-7 [Abstract]

12. Spits C., Mateizel I., Geens M. et al. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1361-3 [Abstract]

13. Guan X.Y., Horsman D., Zhang H.E. et al. Localization by chromosome microdissection of a recurrent breakpoint region on chromosome 6 in human B-cell lymphoma. Blood 1996; 88: 1418-22 [Abstract]

14. Hurst C.D., Fiegler H., Carr P. et al. High-resolution analysis of genomic copy number alterations in bladder cancer by microarray-based comparative genomic hybridization. Oncogene 2004; 23: 2250-63 [Abstract]

15. Koynova D.K., Jordanova E.S., Milev A.D. et al. Gene-specific fluorescence in-situ hybridization analysis on tissue microarray to refine the region of chromosome 20q amplification in melanoma. Melanoma Res. 2007; 17: 37-41 [Abstract]

16. Midorikawa Y., Yamamoto S., Ishikawa S. et al. Molecular karyotyping of human hepatocellular carcinoma using single-nucleotide polymorphism arrays. Oncogene 2006; 25: 5581-90 [Abstract]

17. Iejima D., Minegishi Y., Takenaka K. et al. FRS2beta, a potential prognostic gene for non-small cell lung cancer, encodes a feedback inhibitor of EGF receptor family members by ERK binding. Oncogene 2010; 29: 3087-99 [Abstract]

 Источник: celltranspl.ru